ABW® 诱导多能干细胞培养方案

ABW® Induced Pluripotent Stem Cell（iPSC）Culture Protocols

一、培养材料

1、试剂：ABW® Matrigengel（REF: 0827775）；ROCK 抑制剂（Y-27632）；DMEM F12/DMEM；mTeSR1/E8培养基；Accutase解离剂、PBS(D-PBS）

2、耗材：无菌枪头；六孔板；无菌EP管。

二、培养准备

1、材料预冷：

a、将ABW® Matrigengel 置于冰盒中，放入 4℃冰箱，使胶能过夜缓慢融化;

b、4℃预冷无菌离心管、无菌枪头、六孔板、DMEM F12/DMEM；

2、将ABW® Matrigengel（REF: 0827775）以1：80或1：100比例进行稀释：

a、将适量4℃的DMEM F12/DMEM移入冷却的15/50 mL EP中;

b、使用移液器将预冷的枪头从EP管吸取DMEM F12/DMEM中移入分装好的ABW® Matrigengel，再吸取转移至EP管内；重复几次，直到基质胶*移入到EP管中。

c、按比例混合后作为储备基质胶混合液，进行后续铺板；

3、制作基质胶涂层

a、按1mL/孔将基质胶混合液加入预冷的六孔板中，轻轻晃动以确保混合液均匀铺在板上；

b、将6孔板转移到37℃孵育过夜（板材可以在孵育一小时后即可使用，但过夜孵育的涂层对细胞培养效果更佳）；

c.使用前吸去涂层上方液体。

4、配置ROCK 抑制剂（Y-27632）工作液：使用无菌PBS将Y-27632溶解，配置成10mM溶液（1000X），工作浓度为10μM;

5、配置含ROCK抑制剂mTeSR1/E8培养基：将10mM溶液加入mTeSR1/E8培养基至终浓度为10μM。

注意：ABW® Matrigengel在>4℃时会逐渐聚合成胶，请严格把控操作温度，控制操作时间；稀释后的基质胶混合液同样需要冰上操作。

一、细胞培养

1、复苏iPSC

a.从液氮罐或干冰中取出ipsc，37℃水域中解冻，解冻应迅速完成；

b.用75% 酒精消毒冻存管后转移到超净台/生物安全柜；

c.将细胞溶液转移到新的15ml EP管中，用DMEM F12/DMEM冲洗冻存管两次

d.室温 300g 离心5min（ipsc对于200-300g的转速都有较好的耐受性，建议使用300g来z.大限度捕捉细胞，标准程序下建议使用200g）;

e.弃上清，用2mL含有ROCK抑制剂的培养基轻柔地重悬iPSC后转移到用铺好板的孔中，前后摇动使得细胞均匀分布（建议将每瓶细胞1*10 6装在六孔板的一个孔内使细胞存活率zD化）

f.将六孔板放回37℃培养箱，（请在细胞被转移后立即执行，避免细胞中.央密度增加）

g.次日撤去ROCK抑制剂，即用无抑制剂的培养基替代含抑制剂的培养基培养细胞。

注意：细胞培养过程中不提倡使用抗生素，其会干扰细胞和其分化潜能；培养环境应与其他细胞隔离，两次传代后检测支原体；DMSO在室温下对细胞有毒，复苏步骤应快速完成

2、iPSC传代

a.将培养上清吸去，用1mL的PBS清洗后加入1mL Acuutase；

b.转移到37℃培养箱3分钟，或在显微镜下观察直到大部分细胞脱落（若细胞仍然附着，可将培养板放在手上，另一手轻轻在你的手上拍打使板发生轻微震动从而使细胞脱落）；

c.传代前准备好基质胶涂布的六孔板

d.倾斜培养板，将Accutase溶液沿培养层表面转移两次，分离结块并转移到离心管中

e.用DMEM F12/DMEM冲洗培养层表面，并与管中的细胞溶液合并（使用DMEM/F12或用PBS洗涤，建议使用至少5%的培养基，有利于随后的造粒和附着）；

f.室温下 300g 离心五分钟

g.吸去上清，用含有ROCK抑制剂的培养基进行重悬；

h.将细胞加入到涂层板中，轻轻摇动使细胞分布均匀；

i.将培养板放入37℃培养箱中孵育。

注意：IPSC生长为单层后则会迅速分化并死亡，为了保持生长和多能性，需在其长满前进行传代。

3、iPSC细胞冻存

a.准备细胞和解离液，在解离液解离细胞过程中，将培养基与10%DMSO混合，在冻存管上贴好标签，配置好冻存液（可选20%血清或血清替代物提高存活率， 也可以使用90%胎牛血清+10%DMSO）；

b.分离细胞方法同传代，可以使用细胞计数器来配合进行细胞的冻存；

c. 以1X10^6 冻存每管细胞，之后进行离心、抽吸培养基，然后在适当体积的冻存液中进行重悬；

d.将1ml重悬好的细胞冻存液加到1.5ml冻存管中，并进行程序性降温，在液氮罐中长期保存。

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